1967年，出生在台湾省台北市的一个体育世家，从小特别喜欢打篮球。1979年，担任女子篮球队的职业前锋，打了三年篮球。1982年，在篮球场打球时，一位广告商被她的气质所吸引。随后，对方邀请王祖贤拍摄了一部化妆品的广告片。该广告片播出后，王祖贤由此产生继续学习表演艺术的愿望。初中毕业后，考入国光剧艺实验学校系统地学习表演的专业知识。
1984年，被摄影师宋立平推荐给导演叶金淦，主演其执导的爱情片《今年的湖畔会很冷》，这也是她个人首部电影作品，从而进入演艺圈。
1985年，与尔冬升搭档，联合主演喜剧片《天官赐福》，在片中饰演主张婚姻自由、试图女扮男装逃婚的千金小姐纳兰琼瑶；2月，主演张坚庭执导的爱情片《再见七日情》；8月，出演新艺城影业有限公司出品的喜剧片《打工皇帝》。
1986年3月，主演陈欣健、刘观伟联合执导的动作片《霹雳大喇叭》；4月，在楚原执导的爱情片《偶然》中饰演外表漂亮、身怀秘密的女人茱莉亚；6月，与钟镇涛、周润发联合主演喜剧片《杀妻二人组》；9月30日，其参演的恐怖片《俾鬼捉》上映；10月，与周润发、吕方共同主演动作片《义盖云天》，在片中饰演从中国内地偷渡到香港却不幸流落街头的少女港生；11月，领衔主演剧情片《心动》，在片中饰演个性乐观开朗、争强好胜的广告公司撰稿主任凌祖儿。
1987年，与齐秦共同主演爱情片《芳草碧连天》，在片中饰演毕业于农业专科学校的技术员凌云峰，还参演了该片电影主题曲《花祭》的MV；1月，主演改编自同名小说的科幻片《卫斯理传奇》；7月，与张国荣联合主演爱情片《倩女幽魂》，该片翻拍自20世纪60年代的同名电影，在片中饰演容貌美艳、心地善良、受树妖胁迫被逼害人的女鬼聂小倩，凭借该片获得了第7届香港电影金像奖最佳女主角提名；8月，领衔主演剧情片《香港小姐写真》，在片中饰演当选香港小姐的妙龄少女李倩蓓；12月3日，其出演的喜剧片《标错参》上映；同年，参演歌曲《冬雨》、《空白》的MV。
1988年3月，领衔主演奇幻片《画中仙》，在片中饰演不堪受辱投崖自尽、藏匿于画像的游魂野鬼莫愁；7月，参演刘镇伟执导的喜剧片《金装大酒店》；7月7日，主演的爱情片《长短脚之恋》上映，在片中饰演下肢残疾、负责照顾父亲的女孩阿美；12月，在黄泰来执导的剧情片《法中情》中饰演精神濒临奔溃的模特凌祖儿；同年，出演喜剧片《大丈夫日记》。
1989年1月21日，出演许冠文、黄百鸣主演的喜剧片《合家欢》；4月，与钟镇涛搭档，在动作片《杀手·蝴蝶·梦》中饰演一对情侣；8月，主演银都机构有限公司出品的悬疑片《都市猎人》，在片中饰演生活富足、却与丈夫貌合神离的少妇雷茵；9月，领衔主演剧情片《潘金莲之前世今生》，该片改编自同名小说，在片中分别饰演了生性放荡、死后拒绝喝孟婆汤的少妇潘金莲和潘金莲投胎转世的芭蕾舞团翘楚单玉莲；10月，与林青霞联合主演惊悚片《惊魂记》，在片中一人分饰一对双胞胎姐妹，分别饰演为人和善、被迫偷盗钱财的姐姐王素群和容貌美艳、热衷打扮的妹妹王素娟；12月，参演周润发、刘德华主演的剧情片《赌神》，在片中饰演陈小刀的女友阿珍；同年，与郑裕玲、林忆莲联合出演喜剧片《打工狂想曲》。
1990年5月，与任达华共同主演剧情片《浪漫杀手自由人》，在片中饰演一桩枪击案的目击者少女阿珍；6月28日，主演的奇幻片《漫画奇侠》上映；7月，主演爱情片《倩女幽魂Ⅱ：人间道》，在片中饰演身负血海深仇的忠臣之女傅清风；7月21日，其出演的喜剧片《摩登如来神掌》上映，在片中饰演多才多艺的元朝公主云萝；10月，与张学友联合主演剧情片《都市煞星》，在片中饰演与杀手金鹰坠入爱河的少女高加恩；12月，领衔主演剧情片《阿婴》，在片中饰演闾门县令的独生女阿婴。
1991年1月，主演奇幻片《天地玄门》，在片中饰演外表貌若天仙、被鬼王爱慕的绝色美女施施；4月，在黄泰来执导的爱情片《魔画情》中饰演下嫁血魔的女鬼青青；6月，与王羽联合主演奇幻片《千人斩》，在片中饰演前来向刽子手袁德泰复仇的江南大盗鬼八仙成员玉残花；7月，与梁朝伟、张学友共同主演奇幻片《倩女幽魂Ⅲ：道道道》，在片中饰演容貌美艳、死后葬身兰若寺、被树妖逼迫害人的女鬼小卓，凭借该片获得西班牙锡切斯奇幻电影节最佳女主角；10月，领衔主演奇幻片《灵狐》，在片中饰演发誓为狐群复仇、试图引诱以贩卖狐裘为业的卫家公子卫十郎的狐狸精胡雪姬；同年，出演了电视电影《香港来的女人》。
1992年2月，出演王晶执导的剧情片《赌城大亨之新哥传奇》，在片中饰演傅家骏的妻子程乐儿；8月20日，其参演的剧情片《庙街十二少》上映，在片中饰演被庙街青年十二少爱慕的女孩德兰。
1993年，出演了长宏影视股份有限公司出品的古装片《新流星蝴蝶剑》，在片中饰演与杀手孟星魂志趣相投的妻子小蝶；1月，与成龙、后藤久美子、邱淑贞共同主演喜剧片《城市猎人》，在片中饰演私家侦探孟波的女助手中村惠香；1月16日，与林青霞合作拍摄的武侠片《东方不败风云再起》上映，在片中饰演日月神教教主东方不败对爱情无比忠贞的妾侍雪千寻；2月，在刘镇伟执导的喜剧片《射雕英雄传之东成西就》中饰演黄药师的小师妹素秋；5月，与梁家辉、徐锦江联合主演古装片《水浒传之英雄本色》，在片中饰演性格温柔贤惠、常常劝丈夫脱离险恶官场的林冲妻子；9月，主演胡金铨执导的恐怖片《画皮之阴阳法王》，在片中饰演不幸被雷击而亡的戏子尤枫；11月4日，与张曼玉共同主演的奇幻片《青蛇》上映，该片改编自同名小说，在片中饰演天性善良、修行千年的白蛇白素贞。
1994年，逐渐淡出演艺圈。1997年，与绪形直人搭档，联合主演科幻片《北京猿人》，在片中饰演女特工宗美美。1998年3月，发行音乐专辑《与世隔绝》；同年，参演了歌曲《悬崖》的MV。
2001年4月6日，与宫泽理惠共同主演的爱情片《游园惊梦》上映，在片中饰演荣家的亲戚、任职教师的民国女子荣兰，该片被美国《时代》杂志评为十大电影之一。
2005年，主演彭小莲执导的剧情片《美丽上海》，在片中饰演在美国工作的电子工程师；同年，宣布全面退出演艺圈。
1989年，因拍摄电影《芳草碧连天》与歌手齐秦相恋。1998年，双方在台北市购买房屋准备结婚。2003年，齐秦的前妻要求对方认养儿子，两人分手。
1993年，在石岗镇捐资10万元港币修建了当地第一条柏油马路；1月，参加电影《射雕英雄传之东成西就》的慈善义演；6月，出席台湾反毒公益活动。
香港电影金像奖
锡切斯国际奇幻电影节
王祖贤与张曼玉、钟楚红、关之琳并称20世纪90年代香港影坛四大名旦。她拥有清纯甜美的外貌、修长匀称的身材，非常敬业。在电影《天官赐福》里，把角色身着男装时风流潇洒而又不失红颜本色的妩媚多姿，演绎得活灵活现。在《倩女幽魂》中，凭借迷离的眼神、幽怨的气质将身世凄惨、善良多情的鬼魂刻画地入木三分。
王祖贤气质冷艳，适合饰演冰火性情的女子。在电影《东方不败之风云再起》中，她的扮相给人极度的冷艳凄美之感。在《青蛇》里，她突破了传统的温文尔雅的白娘子形象，将白蛇的妖性展现十足。现实生活中的她个性直爽，很讲原则，是一位镜头感很好的艺人。
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